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常用的八种免疫组织化学染色方法(上)

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常用的免疫组化染色方法很多,有直接法和间接法。直接法是将酶或荧光素等标记在第一抗体上,然后用该被标记的第一抗体与组织细胞中的抗原结合,即可以显色或在荧光显微镜下观察结果;

 

间接法是将标记物标记在第二抗体或第三抗体(复合物)上,其方法是先将特异性的第一抗体与组织细胞中相应的抗原结合,再将被标记上标记物的第二抗体与第一抗体结合,最后用显色剂显色或在荧光显微镜下观察结果。

 

如果标记物是标记在第三抗体(复合物)上,则第二抗体与第一抗体结合后,再用被标记上标记物的第三抗体(复合物)与第二抗体结合,最后用显色剂显色或在荧光显微镜下观察结果。

 

常用的EPOS一步法属于直接法,EnVision二步法、PAP/APPAP法、LSABS-P)法、SABC法、和CSA法等属于间接法。相对来说直接法特异性高,敏感性低,而间接法则敏感性高,特异性低。

 

01
PAP 法
 
 

过氧化物酶抗过氧化物酶(peroxidaes anti-peroxidaesPAP)法属于非标记抗体法,该方法的主要技术是通过制备具有高特异性的抗过氧化物酶抗体,并在抗酶抗体中加入过量的过氧化物酶,使过氧化物酶充分结合在抗酶抗体上形成可溶性的PAP复合物。

 

用于制备PAP复合物时免疫的动物主要是鼠和兔,所以制备出的PAP复合物分别为鼠(mousePAP复合物和兔(rabbitPAP复合物。

 

PAP法为三步法,除了PAP复合物外,还需要有第二抗体,该第二抗体中的IgG有两个Fab片段,一个与特异性第一抗体结合,另外一个与PAP复合物结合,最后通过PAP复合物上的酶参与显色反应而形成有颜色的不溶性沉淀物。

 

由于第二抗体中IgG的两个Fab片段是相同的,所以,与之结合的第一抗体和PAP复合物中的抗酶抗体是来源于同源动物。

 

在检测抗原时要注意抗体的配对,如第一抗体是鼠抗,第二抗体应该为抗鼠的IgG,与鼠PAP复合物结合。同样如果第一抗体是兔抗,第二抗体为抗兔的IgG,与兔PAP复合物结合。如果配对错了,抗体之间就连接不上,染色就失败。

 

此外,显色剂也要与PAP复合物上的酶相配对,PAP复合物上结合的酶为过氧化物酶,显色底物用DABAEC

 

 
 
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02
APPAP 法
 
 

碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(alkaline phosphatase anti-alkaline phosphataseAPAAP)法也属于非标记抗体法,该方法的主要技术也是通过制备具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体,并在抗酶抗体中加入过量的碱性磷酸酶,使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上形成可溶性的APAAP复合物。

 

APPAP法的原理、操作步骤等和PAP法基本相同,所不同的是在染色操作过程中不需要用H2O2消除内源性过氧化物酶,所用的显色剂为固蓝、固红或BCIP/NBT等。

 

 
 
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03
ABC 法
 
 

卵白素-生物素复合物(avidin biotin complexABC)法属于亲和免疫组织化学技术,该方法是根据卵白素和生物素具有高度亲和力的生物学特性,用生物素与过氧化物酶结合获得生物素化过氧化物酶,生物素化过氧化物酶再和加入的卵白素形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物即ABC复合物。

 

ABC法为三步法,第二抗体为生物素化的IgG,其中的Fab片段和第一抗体结合,生物素和ABC复合物中的卵白素结合,最后通过ABC复合物上的过氧化物酶参与显色反应而形成有颜色的不溶性沉淀物。由于卵白素和生物素的亲和力极强,所以ABC法较敏感,比PAP法敏感2040倍。

 
 
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04
LSAB(S-P) 法
 
 

标记抗生物素蛋白链菌素-生物素(lablled streptavidinbiotin)法ABC法相似,不同处是在第二抗体之后ABC法用ABC复合物而LSAB法用标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链菌素(streptavidinSA)。SA是从链霉菌属蛋白分离出来的一种蛋白质,它仅标记了过氧化物酶而本身没有与生物素连接,生物素是连接在第二抗体上。

 

由于SA分子量较小,ABC复合物分子量大,因而SA穿透组织的能力比ABC复合物大,反应速度快。SA有两个和生物素亲和力极高的结合点,其本身没有连结生物素,可以与第二抗体上的生物素连结。这样,SAABC复合物更容易与第二抗体上的生物素结合,因而SA的敏感性比ABC高,反应所需的时间比ABC短。

 
 
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以上就是前四种种常用的免疫组织化学染色方法的简介。如在实验中遇到困难,也可以选择Leica全自动免疫组化染色仪来协助您。

 
 
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下期预告

酶标聚合物(labelled dextran polymerLDP)法

增强聚合物一步(enhanced polymer one setpEPOS)法

催化信号放大(catlyzed signal amplificationCSA)法

抗生物素蛋白链菌素-生物素复合物(streptavidin biotincomplexSABC)法

 

 

 

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